山东（LY）管网建设城投债权项目（山东管网公司）

纤维化（Fibrosis）是一种累及多个器官、不可逆转的病理过程山东（LY）管网建设城投债权项目，它的形成是指胶原蛋白（collagen）、纤维粘连蛋白（fibronectin, FN）、α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin, α-SMA）等细胞外基质（extracellular matrix, ECM）过度堆积山东（LY）管网建设城投债权项目，成纤维细胞向肌成纤维细胞分化山东（LY）管网建设城投债权项目，实际上这是器官组织修复的一个重要阶段。但是当组织受到严重的重复性损伤时山东（LY）管网建设城投债权项目，局部组织成纤维细胞被激活，增强收缩性的同时，增加炎症介质的分泌，ECM成分积聚，导致组织结构破坏，器官功能障碍，最终衰竭走向死亡，因此纤维化被认为是导致多种疾病发病率、死亡率升高的主要原因之一[1-3]。临床上多见肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化、心肌纤维化等病症，尽管这些纤维化疾病的病因及临床表征不尽相同，但是病机大同小异。

肺纤维化，是一种由于长期接触有毒物质、慢性感染或自身免疫反应等原因导致过量的以胶原为主的细胞外基质沉积，肺实质间质结构改变，正常肺壁增厚，气体交换减少和通气受限，以进行性加重的呼吸困难、慢性干咳为主要表现的慢性肺间质疾病，该表现一旦发生往往难以逆转，若持续发展，肺功能进行性恶化，可致呼吸衰竭[4-5]。肝纤维化是肝损伤和验证后组织修复过程中的一种代偿反应，以细胞外基质再肝内过量沉积为病理特征（包括胶原蛋白、非胶原糖蛋白、蛋白多糖，其中以胶原蛋白的增生更为突出），是各种慢性致病因素共有的病理改变，诱导细胞转变为肌成纤维细胞，并发生表型及功能改变[6]，进一步将发展为肝硬化，肝硬化是不可逆转的。肾纤维化（renal fibrosis, RF）是原发或继发慢性肾脏病发展至终末期肾衰竭的共同病理途径，以肾小管萎缩、肾小球硬化为主要特征。当肾脏组织受损后，肾间质会出现炎症细胞浸润，肾小管上皮细胞也会凋亡，而来源于肾小管上皮细胞-间充质转化的肌成纤维细胞将会聚集并使细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的生成与降解失衡，从而导致ECM过度沉积，进而引发肾纤维化[7]。

诱导细胞纤维化常用方法

转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β），是一种多效性细胞因子，可以调节细胞生长、分化、ECM重构、内皮间质转化等。目前已发现TGF-β家族存在5种亚型，在哺乳动物中TGF-β家族包括3种不同的亚型（TGF-β1， TGF-β2和TGF-β3），它们的序列和结构具有较高的相似性（70-82%），在体内也具有相似的生物功能[8]，其中TGF-β1在各种组织中的表达水平、生物活性较好，对纤维化疾病的发展有较大影响。相关研究表明，TGF-β可以促进特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）的发生，介导人肺泡上皮细胞发生上皮间质转化（Epithelial-MesenchymalTransition, EMT），激活间质细胞，合成ECM，为IPF的发生和发展提供一个有利的微环境；TGF-β可以诱导肾间质细胞纤维化，促进细胞凋亡；TGF-β诱导肝脏星状细胞（Hepatic stellate cells, HSCs）的肌成纤维细胞样特性，产生ECM导致纤维化，虽然TGF-β在基础条件下抑制肝细胞的增殖，但在恶性肿瘤的发展过程中，它通过刺激上皮细胞向间质细胞过渡，具有促癌特性。

Fig. 1：TGF-β信号传导在组织纤维化中的致病作用[8]

目前，诱导细胞纤维化多用TGF-β1。Guo等[9]研究结果表明，10ng/mL TGF-β1孵育肺癌细胞（LX-2）24h，可以显著促进α-SMA及collagen I蛋白的表达；Liu[10]等通过对不同浓度（5、10ng/mL）TGF-β1孵育HE-2细胞不同时间（24、48h）进行差异化分析，结果表明10ng/mL 孵育细胞48h效果更为明显；Wang等[11]研究发现，10ng/mL TGF-β1分别孵育肾成纤维细胞（NRK49F）24h和72h，α-SMA表达有显著差异，72h纤维化程度更重；另有研究表明不同血清浓度同样会影响TGF-β1诱导的纤维化程度。因此，在不同细胞内使用TGF-β1诱导纤维化，可以进行不同的孵育时间、浓度、及血清含量 的摸索，以确定最佳造模方案。

Fig. 2: The qPCR result picture from ICE

Fig. 3: The Western blot result picture from ICE

纤维化疾病的治疗

有大量研究表明，通过抑制TGF-β的表达，可以调节多种细胞内信号通路（包括：典型信号通路和非典型信号通路）发挥抑制纤维化的关键作用。

1. TGF-β典型信号通路（TGF-β1/Smad2/3）TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、TβR-Ⅲ为TGF-β受体的三个亚型，激活的TβR-Ⅰ磷酸酯细胞质蛋白称为Smads，该蛋白是TGF-β的直接作用底物。Smads 蛋白可以分为三个类别：受体激活型Smads （R-Smads），包括：Smad1、Smad2、Smad3、Smad5 、Smad8、Smad9；共同介质Smads （Co-Smads ），包括：Smad4 ；抑制型Smads（I-Smads），包括：Smad6 、 Smad7[8]。

有研究表明， TGF-β1 被释放和激活与 TβR-II相结合，但是不能单独与TβR-Ⅰ结合需要TβR-Ⅱ共同参与，TGF-β途径的启动涉及配体与TβR-Ⅱ的结合，形成TβR-Ⅱ和TβR-Ⅰ之间形成异源四元复合物，通过磷酸化并激活 TβR-I 激酶，进而磷酸化并激活下游的 Smad2 和 Smad3。丝氨酸残基的C末端磷酸化的Smad2及Smad3，招募Smad4并与其形成复合物，转移至细胞核，调控TGF-β靶基因的转录。

Fig. 4: The picture from ICE

目前有研究表明慢阻肺患者TGF-β水平较正常人高，Wu等[12]研究发现调控慢阻肺患者TGF-β/Smad信号通路可以减少慢阻肺的气道重塑。蔡丹磊等[13]研究结果表明与对照组相比，感染组慢阻肺患者、未感染组慢阻肺患者TGF-β1、Smad2、Smad3表达量升高，且感染组慢阻肺升高更明显，TGF-β1与Smad2、Smad3的表达量呈正相关，与对照组相比，感染组慢阻肺患者、未感染组慢阻肺患者Smad6、Smad7的表达量降低，且感染组慢阻肺降低更明显，TGF-β1与Smad6、Smad7呈负相关，亦提示TGF-β1/Smads信号通路参与慢阻肺进程。因此，通过调控该通道，可以改善疾病纤维化的进程，抑制疾病发展。

2. TGF-β非典型信号通路

2.1 WNT通路Wnt蛋白是分泌型糖蛋白，与Frizzled家族的细胞膜受体和共同受体脂蛋白受体相关蛋白5/6（LRP5/6）结合，这种结合引发山东（LY）管网建设城投债权项目了信号级联反应，阻止了β-catenin的磷酸化和降解，致使β-catenin蛋白信号持续上调，刺激参与fibrosis反应的靶基因的转录（包括纤连蛋白、PAI-1、Snail1、MMP-7以及肾素-血管），使其能够转移到细胞核中，抑制WNT/β-catenin信号转导可以抑制细胞fibrosis。张秉芬等[14]研究表明，肺纤维化可以激活Wnt/β-catenin 信号通路，延龄草可以抑制Wnt 3α及β-catenin表达水平，通过抑制通路激活发挥对肺纤维化的治疗作用。

2.2TGF-β诱导JAK/STAT通路[15]JAKs是与受体相关的酪氨酸激酶，在介导细胞因子和生长因子信号方面发挥重要作用。细胞因子与其受体的结合激活了相关的JAK激酶，这些激酶相互磷酸化并使受体的细胞质尾部的酪氨酸残基磷酸化。这反过来又产生了细胞质转录因子的对接点，如转录信号转换器和激活器（STAT）蛋白，然后被JAKs磷酸化和激活[16]。被激活的STATs二聚体并转移到细胞核中，在那里调节目标基因的转录。Liu等[10]研究表明，STAT3被 JAK1磷酸化后，在ALK5的下游发挥作用，介导CTGF/CCN2的表达。

有研究发现，TGF-β1上调胰腺星状细胞中JAK2和STAT3的表达，同时促进COL-Ⅰ的分泌，表明TGF-β1可能通过上调JAK2/STAT3信号通路诱导PSC分泌COL-Ⅰ，进而促进胰腺纤维化的发展[17]。Yu等[18]在胰腺中的研究也发现，激活JAK2/STAT3信号通路可以上调TGF-β1的分泌，而抑制JAK2/STAT3会下调TGF-β1和α-SMA的分泌， 进而减轻胰腺炎和胰腺纤维化的发展。

Fig. 5: JAK2、STAT3、TGF-β表达情况[18]

None：空白对照；15d：用15d-PGJ2和cerulein处理的细胞；Tro：用troglitazone和cerulein处理的细胞。

2.3有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）TGF-β1可以激活MAPKs ，MAPK家族包括三个主要的激酶：p38 MAPK、c-Jun终端激酶（JNK）和细胞外信号调节激酶（ERK），MAPKs可以磷酸化Smad蛋白的连接区，以调节Smad3的转录活性。

2.3.1 TGF-β诱导ERK 通路TGF-β可诱导其信号受体TβRII和ALK5上的酪氨酸残基磷酸化，然后通过招募接头蛋白生长因子受体结合蛋白2 (Grb2)/ SOS (son of sevenless, SOS)通过顺序激活Ras、Raf和MEK1/2来激活ERK1/2。激活的ERK可以使转录因子(如Jun, Fos等)磷酸化，这些转录因子在不激活或与激活的Smad复合体结合时控制基因表达。此外，ERK还可以直接磷酸化连接区Smad蛋白，负向调控其活性。

Fig. 6: The picture from ICE

2.3.2 TGF-β诱导 JNK/p38 通路[11]配体结合的TGF-β受体与TRAF6和TGF-β活化激酶1 (TAK1)相互作用，诱导lys63连接的TRAF6多泛基化，进而激活TAK1和下游激酶，如JNK、p38 MAPK和IKK。活化的JNK和p38 MAPK磷酸化它们的靶向转录因子，IKK磷酸化核因子κB (NF-κB)，这些转录因子与活化的Smads协同调控细胞凋亡和上皮间充质转化(epithelial-tomesenchymal transition, EMT)。此外，JNK可直接磷酸化受体激活的Smad (R-Smad)，调节Smad活性。另有研究表明，Smad6通过招募去泛素化酶A20到去泛素化晚期TRAF6来抑制TGF-b诱导的JNK和p38 MAPK的激活[19]。

Fig. 7: The picture from ICE

2.4 TGF-β诱导PI3K-Akt 通路[20]丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白激酶B，通常被称为Akt ，PI3K-Akt调控许多生物学过程，包括细胞存活、增殖和代谢。众所周知， TGF-β可以通过PI3K激活Akt，并且已经报道了smad独立或依赖的机制。PI3K的调控亚基p85被发现与TβRII构成相关，而其与ALK5的关联仅在TGF-β存在时被检测到[21]。TGF-β受体与p85之间的相互作用可能不是直接的，但受体激酶的活性对PI3K的激活至关重要，TbRI激酶抑制剂可以阻断TGF-β诱导的PI3K对Akt的激活。TGF-β诱导的PI3K和Akt信号通路也可以通过受体介导的TRAF6 lys63泛素化激活，这样不仅可以激活TAK1，还可以诱导泛素化、膜募集和Akt的激活。最后，TGF-β还可以通过诱导TGF-α的表达间接激活PI3K-Akt信号，从而激活EGF受体信号，进而激活PI3K-Akt信号。

疾病靶点的筛选

活化的成纤维细胞(肌成纤维细胞)被认为是纤维化形成过程中的主要罪魁祸首。然而，其他类型的细胞，如内皮细胞、上皮细胞、炎症细胞和免疫细胞，已被证明在纤维化的启动和/或进展中发挥关键作用。由于与纤维化过程相关的信号通路的复杂性，有效的抗纤维化疗法的开发一直是一项繁琐的任务。然而，最近出现的高通量组学技术结合计算和机器学习工具，现在正被用于理解复杂的信号机制，进行生物标记物探索研究，以便能够早期识别以及确定干预纤维化疾病的新的治疗靶点，可以进行药物药效研究和机制研究。

Fig. 8: The HCS result picture from ICE

目前ICE具备成熟的TGF-β诱导细胞纤维化的造模技术，可以通过qPCR、Western blot及HCS等实验技术评价造模情况，进而通过转染纤维化相关基因筛选疾病靶点及药物靶点，分析酶学等相关指标，提供药物机制研究等相关服务。

Fig. 9: The ADP Glo Assay result picture from ICE

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